Tema 26 – Métodos de estudio de la célula. Células procariotas y eucariotas. La célula animal y vegetal. Formas acelulares

1. INTRODUCCIÓN

Desde que Hooke diese el nombre de cell a las estructuras que vio en el microscopio, y desde que se formulase la teoría celular, muchos han sido los avances en el mundo de la biología, que han permitido, que esas estructuras vistas por primera vez con un microscopio, sean rudimentarias al lado de las que hoy vemos con nuevos microscopios y más evolucionados.

2. MÉTODOS DE ESTUDIO DE LA CÉLULA.

2.1. Instrumentos de análisis de las estructuras biológicas

Existen dificultades a la hora de observar las células por distintas razones, una de ellas es el tamaño de estas estructuras, imperceptibles a simple vista por el ojo humano, que tiene un poder de resolución de solo 0,1 mm, y casi todas las células tienen un tamaño comprendido entre 10 y 30 micras. La segunda de ellas es que las células son estructuras completamente transparentes, por todo ello, son necesarias una serie de técnicas y de aparatos para poder visualizarlas que se expondrán a continuación.

2.2. Microscopio óptico

El poder de resolución de un objetivo es el valor de la mínima distancia que puede haber entre dos puntos para poder identificarlo como independientes, éste depende del objetivo empleado. El poder de resolución del microscopio óptica ronda las 0,2 µm

Un microscopio está compuesto por varias partes:

Parte mecánica:

– Pie: sobre el que descansan todas las estructuras

– Tubo: donde se sitúa el ocular

– Revólver: giratorio con orificios donde se enroscan los objetivos

– Brazo: donde se sostienen todos los mecanismos

– Platina: lugar donde se coloca el porta con la muestra

– Carro: permite desplazar la preparación

– Tornillo macrométrico: asciende o desciende el tubo

– Tornillo micrométrico: para conseguir un mejor enfoque

Sistema óptico:

– Oculares: donde ponemos los ojos, su aumento se multiplica por el del objetivo puesto

– Objetivos: son los responsables de que la muestra se vea más grande. Los hay de inmersión que utilizan aceites para que la vista sea más nítida.

Sistema de iluminación:

– Foco de luz: el que da la claridad necesaria

– Condensador: debajo de la platina, lugar donde se concentra la luz.

– Diafragma: controla la cantidad de luz, abriendo o cerrándolo.

· Microscopio óptico normal: el material a observar se colorea con colorantes específicos que aumentan el contraste y revelan detalles que no se aprecian de otra manera.

· Microscopio óptico de campo brillante: el material se observa sin coloración. La luz atraviesa el objeto y se observan detalles que estén naturalmente coloreados.

· Microscopio de contraste de fases: se basa en que, aun cuando las estructuras biológicas son sumamente transparentes a la luz visible, introducen cambios de fase en las radiaciones que las atraviesan. Este tipo de microscopía se usa como método de rutina en la observación de células y tejidos vivientes, fundamentalmente en la observación de células cultivadas in vivo. En éstas, usando cinematografía con intervalos, se observan fácilmente los diferentes cambios nucleares, citoplasmáticos que tienen lugar durante la división celular.

· Microscopio de interferencia: se basa en principios similares a los de la microscopía de fase, pero tiene la ventaja de dar resultados cuantitativos. Es posible determinar las diferencias ópticas de dase para las diversas estructuras celulares y en consecuencia, medir su peso en seco. Se usa en microbiología y en técnicas de reproducción asistida

· Microscopio de campo oscuro: El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por las estructuras del espécimen. Para lograrlo, el microscopio de campo oscuro está equipado con un condensador especial que ilumina la muestra con luz fuerte indirecta. En consecuencia el campo visual se observa como un fondo oscuro sobre el cual aparecen pequeñas partículas brillantes de la muestra que reflejan parte de la luz hacia el objetivo. . Útil para detectar Treponema pallidum causante de la sífilis.

· Microscopio de polarización: se fundamenta en el comportamiento que tienen ciertos componentes de la célula cuando son observados con luz polarizada. Este microscopio lleva agregados el polarizador y un analizador. Se utiliza para analizar indirectamente la ultraestructura de la célula.

· Microscopio de fluorescencia: algunos colorantes denominados fluorocromos tienen la propiedad de ser excitador cuando absorben luz UV. A medida que las moléculas excitadas regresan a su estado normal liberan el exceso de energía en forma de luz visible de mayor longitud de onda que la radiación excitante. Esta propiedad se denomina fluorescencia.

· Microscopio electrónico: es capaz de aumentar la imagen unas 250.000 veces. Posee un gran poder de resolución, de aproximadamente 2 Å. Este poder se consigue utilizando una iluminación de onda más corta que la de la luz, con haces de electrones. Los electrones pasan por el vacío que hace que los acelere y después inciden sobre la muestra que debe estar completamente deshidratada y en el vacío. Las preparaciones han de ser mucho más finas que en el caso de los microscopios ópticos.

· Microscopio electrónico de transmisión: permite observar muestras en cortes ultrafinos. el haz de electrones incidente atraviesa la muestra o espécimen  observado y la sombra de detalles finos o ultra-estructura es capturada en una pantalla fosforescente  con propiedades de emisión de luz, ubicada en la parte inferior de la columna.

· Microscopio electrónico de barrido: en este caso los electrones no atraviesan la muestra, sino que por el contrario chocan contra la superficie que ha sido revestida con un material pesado como el oro, dando así una imagen en 3 dimensiones.

· Difracción de rayos X: proporciona una mayor resolución. Consiste en que un haz fino de rayos X atraviese el material que será analizado y colocado detrás de una placa fotográfica que recoge el espectrograma. Podemos observar muestras gruesas y sin tratamiento.

2.3. Preparación de muestras para la visualización en los microscopios

Básicamente para las preparaciones del microscopio óptico se procede de la siguiente manera:

– Depositar sobre el porta unas gotas de la muestra a observar. Para evitar que se deseque la muestra se coloca en líquido clarificador o el mismo líquido que la contiene. Hay veces que es necesario fijarlas mediante calor para la preservación de la morfología y composición química de la célula, pero en este caso las células ya no estarían vivas.

– Colocar el cubre

– Acabado: procurar que no se queden burbujas entre el porta y el cubre.

Las células como hemos mencionado anteriormente son transparentes, con lo cual hay ocasiones que para ver ciertas estructuras hay que utilizar una serie de colorantes para poder visualizarlas. Se utilizan tintes. Se sigue un proceso:

– Fijación: utilizar unos determinados compuestos para preservar la morfología y estructura de la célula, se pueden elegir, según la estructura, acetona, formaldehido…

– Lavado: eliminar los restos del fijador mediante agua destilada

– Tinción: cubrir la muestra a visualizar con el colorante elegido durante un determinado tiempo evitando que se deseque.

– Lavado de nuevo para eliminar el excedente de colorante

– Montaje: cubrir con el cubre

Los colorantes más comunes utilizados para la tinción son:

– Catiónicos. Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las células y las tiñen. Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina

– Aniónicos. Con carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no tiñen las células, sino el entorno. En este caso se habla de tinción negativa. Eosina, Nigrosina

– Liposolubles. Se mezclan con los lípidos celulares y los tiñen.
Negro Sudán

Estas técnicas básicamente se utilizan para las preparaciones del microscopio óptico.

En el caso del microscopio electrónico las preparaciones son más trabajosas, por las características del propio microscopio. 

En el caso de las fijaciones no se utiliza el calor, ni sustancias como la acetona, son mucho más específicos, se utiliza para que se conserven los tejidos y se parezcan lo máximo a in vivo, aumentar la dureza del tejido, destruir bacterias… El más utilizado es el tetróxido de Osmio. Reacciona muy bien con los lípidos. En las proteínas produce una gelificación. También se puede utilizar el formaldehido, el glutaraldehído…

Otra manera de fijar la muestra es por congelación-desecación, que consiste en una rápida congelación y la deshidratación en el vacío a baja temperatura. Las ventajas es que no produce retracción del tejido, la fijación es homogénea en todo el espesor de la pieza, no hay extracción de sustancias solubles, la composición química se mantiene, la estructura también se mantiene. Otra variación es la congelación-sustitución, que consiste en rápida congelación, manteniéndose en un líquido reactivo como metanol o etanol, que disuelve los cristales de hielo.

Una vez fijadas las muestras, éstas deben de cortarse. Para ello se utilizan los microtomos, que pueden ser automáticos o manuales. En microscopía electrónica se utilizan de congelación o criotomos o microtomos de hoja de vidrio o diamante, puesto que será más fácil sacar láminas ultrafinas de muestras congeladas que no en fresco. En el caso de los microscopios ópticos se pueden incluir en determinados materiales que le dan rigidez como la parafina o celoidina.

El tejido fijado y cortado se rehidrata pasándolo previamente por un solvente intermedio (xileno o tolueno para la parafina)

El siguiente paso es la tinción, con los colorantes antes mencionados, cabe destacar que cada estructura es afín por un determinado colorante y podemos realizar tinciones en el que las diferentes estructuras de las células se tiñan de diferentes colores, estos tintes son los paraópticos.

Un ejemplo de tinción es la tinción de GIEMSA es un método habitual para el examen de frotis sanguíneos y otro tipo de muestras biológicas, que permite la tinción diferencial de zonas con un alto contenido de ADN, y concretamente de uniones A-T. Esto permite distinguir perfectamente en microscopio óptico el núcleo celular, los cromosomas durante la mitosis, y en algunos casos, incluso el ADN mitocondrial.

Otro método muy utilizado son las tinciones gram + y gram – empleado en microbiología para la visualización de bacterias, las gram + se verán de color violeta y las gram – de color rosa.

Los métodos de fraccionamiento celular consisten en la homogeneización o destrucción de los límites celulares, por medio de diferentes medios, como la centrifugación u otros procedimientos químicos. Es importante para el estudio de los diferentes componentes celulares. Existen varios métodos, los más usados son la homogeneización o desintegración mecánica de la célula en un medio acuoso.

Otro método es el inmunocitológico que se basa en la reacción antígeno-anticuerpo. Se une a la γ-globulina a un colorante fluorescente o a una molécula opaca, otra manera es que el complejo antígeno-anticuerpo no marcado reacciona con un anticuerpo antiglobulina, marcado con fluoresceína para hacer visible el complejo con microscopía de fluorescencia o con ferritina para su observación en microscopía electrónica.

Uso de sustancias marcadas con radioisótopos. La sustancia es incorporada a la célula y luego se la localiza utilizando una emulsión fotográfica, puesto que los radioisótopos tienen la propiedad de actuar sobre los cristales de bromuro de plata de la emulsión.

3. CÉLULAS PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS

La complejidad de las eucariotas sugieren que éstas surgieron después de las procariotas. Para explicar esto, existen dos teorías:

– Teoría autógena: estipula que la célula eucariota apareció por la formación progresiva en el seno del citoplasma de compartimentos especializados y por incremento sucesivo del tamaño de las células

– Teoría endosimbiótica: se basa en que las mitocondrias y cloroplastos tienen unas dimensiones parecidas a las de las bacterias, además contienen ADN, ARNm, ribosomas y ARNt. Pueden multiplicarse independientemente del núcleo celular mediante la replicación de su ADN, y sintetizan parte de sus proteínas bajo el control de sus propios genes.

Se supone que fueron bacterias que pasaron a ser huéspedes de bacterias más grandes y se estableció una simbiosis, lo que acabaría dando los primeros eucariotas unicelulares. Les beneficiaba esta simbiosis porque la vida en el interior era más permisiva que la vida en el exterior.

4. CÉLULA VEGETAL Y ANIMAL

Las células in vivo solo se pueden observar en el microscopio óptico, ya que para el electrónico, se necesitan hacer una serie de procedimientos que las mata. También es necesario proporcionar un medio isotónico para evitar o la turgescencia o la plasmólisis.

Los orgánulos extraídos de la célula, se expanden o retraen de acuerdo con los cambios de presión osmótica, siguiendo la ley de Boyle-Mariotte. Este fenómeno depende de la existencia de membranas.

Para observar las estructuras hacemos preparaciones para el microscopio óptico, donde observamos los orgánulos que se pueden observar con el m.o. para ver la ultraestructura veremos utilizaremos el microscopio electrónico.

5. FORMAS ACELULARES

5.1. Virus

Cualquier agente capaz de producir una infección contagiosa. Esto perduró hasta el siglo XIX, cuando empezaron a conocerse agentes microbianos específicos para cada enfermedad infecciosa.

Ivanowsky trabajó con plantas con el virus del mosaico del tabaco, a los que denominó virus filtrantes porque aunque los filtraba se mantenían los agentes infecciosos.

En el siglo XX se propuso que eran microorganismos que diferían de los demás por su tamaño. Beijerink descubrió que el VMT tratado con alcohol seguía infectando, estas propiedades no las presenta ningún otro microorganismo.

Stanley, descubrió que el principio infeccioso eran cristales de naturaleza proteica. También lleva una pequeña molécula de ácido nucleico. Así se llegó al concepto de virus, que son los agentes infecciosos más pequeños que contienen una molécula de ácido nucleico. Capaces de alternar entre dos estados, extracelular e intracelular.

En estado extracelular son inertes y se denominan viriones. Solo transportan ácidos nucleicos de la célula donde se ha producido a la próxima a infectar. En esta fase se realiza la replicación, produciéndose ácido nucleico y los demás componentes del virus.

Pueden perjudicar, invadiendo las células e infectándola o incluso pueden ser beneficiosos como agente hereditario. Se pueden considerar como seres vivos porque son capaces de controlar la síntesis de proteínas víricas, pero desde el punto de vista fisiológico, la reproducción no se produce sin otra célula, con lo cual no serían seres vivos.

Para explicar su origen, se han propuesto varias hipótesis:

– Los virus se volvieron parásitos de los primeros organismos celulares y los virus actuales son los descendientes directos de estas estructuras subcelulares.

– Los virus no son organismo individuales, sino componentes de las células

– Los virus han evolucionado a partir de bacterias patógenas que experimentaron un proceso evolutivo retrógrado

– Han surgido de forma independiente.

5.2. Viroides

Son partículas infecciosas de tamaño muy pequeño sensibles a la ribonucleasa y resistentes a la desoxirribonucleasa, calor y fenol, lo que se supone tienen ácido nucleico son proteínas. ARN monocatenario, y que presentan estructura secundaria con apareamientos intercatenarios. Información genética solo para su replicación, que se realiza en el núcleo de la célula huésped. Puede desorganizar a la célula porque interfiere dicha síntesis en la formación de ARNm. Enfermedades de plantas como el mosaico del crisantemo o clorosis del pepino…

5.3. Priones

Enfermedades crónicas y degenerativas del SNC de los animales y del hombre, como el prurito lumbar de las ovejas, ataxia degenerativa endémica y la enfermedad de Creutzfeld-Jacob (demencia presenil). Prusiner consiguió aislarlos de la sustancia amiloide de los enfermos. Eran glicoproteínas capaces de transmitir la enfermedad, infecciosas de bajo peso molecular no antigénicas, con gran tendencia a la agregación y que al microscopio electrónico se observan como fibrillas de 20 por 200 mm. Resistentes a las sustancias y procedimientos que inactivan los virus pero se inactivan por sosa 0,1 N.

Para su replicación necesitan el material genético de la célula, pues ellos son demasiado pequeños para contenerla ellos mismos. El material genético de la célula uqe necesita el prión normalmente no se expresa, pero el prion la desrepresa y produce la enfermedad.

6. BIBLIOGRAFÍA

– Alberts y otros. Biología molecular de la célula, Omega, 1986.

– Oparín. El origen de la vida, Dover, 1952

– Paniagua Gómez-Álvarez. Biología celular. Mc Graw-Hill interamericana de España S.A. 1999